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大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化方法
更新時間:2013-01-08   點擊次數(shù):1189次

*天:

1. 將適合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上,在37°C下過夜培養(yǎng)

2. 高溫滅菌大的離心瓶(250-500ml)以備第二天搖瓶用

3. 準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升),保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用

第二天:

4. 轉(zhuǎn)移0.2-1ml過夜培養(yǎng)物至裝有500ml LB(或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基)的1-2升搖瓶

5. 37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-6小時

6. 定時監(jiān)控OD600值(培養(yǎng)1小時后每半小時測定一次)

7. 當OD600值達到0.5-1.0時,從搖床中取出搖瓶,置于冰上冷卻至少15分鐘(需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時)

8. 細胞在4°C 5000g下離心15分鐘,棄上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天)

9. 用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升),然后加水稀釋至離心管的2/3體積。

10. 照上面步驟重復離心,小心棄去上清液

11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞

12. 離心,棄上清液

13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細胞

14. 照上面步驟離心,小心棄去上清液(沉淀可能會很松散)

15. 用10%甘油重懸浮細胞至zui終體積為2-3ml

16. 將細胞按150μl等份裝入微量離心管,于-80°C保存

轉(zhuǎn)化方法:

1. 在冰上解凍電感受態(tài)細胞添加1-10μl DNA,冰上培育約5分鐘

2. 添加1-3μl DNA,冰上培育約5分鐘

3. 轉(zhuǎn)移DNA/細胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器(無泡)中

4. 加載P1000,準備好300μl LB 或 2xYT

5. 對電穿孔容器進行脈沖(200 歐姆, 25μFd,2.5 千伏)(檢查時間常數(shù),應該在3以上)

6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中

7. 37°C下培養(yǎng)細胞40分鐘至1小時以復原

8. 轉(zhuǎn)移細胞至適當?shù)倪x擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)

詳情請看:大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化方法

 

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